肿瘤细胞经过坏死、凋亡、排泄向血液中开释的游离 DNA 即为循环肿瘤 DNA（Circulation tumor DNA, ctDNA）。ctDNA 保留了肿瘤特异性基因特征和表观遗传学特征，如癌基因和抑癌基因的点骤变、拷贝数变异、DNA 甲基化和染色体重排，这一特色促进 ctDNA 成为潜在的生物符号物。
ctDNA 作为液体活检的一种办法，因其操作简洁、损害性小、易于动态监测的优势在消化体系肿瘤运用方面得到了广泛研讨。它能够在疾病不一起期发挥作用，帮忙筛查或前期确诊、术后检测剩余病灶及猜测复发、晚期患者辅导靶向用药、动态监测医治反响、判别预后，然后完成个别化医治。
我国发病率前十的恶性肿瘤中, 消化道肿瘤占有五席，且部分瘤种发病率呈上升趋势。因而消化体系肿瘤的前期确诊、作用猜测及改进预后是临床科研工作者的研讨要点。传统活检技能在同一患者身上无法重复屡次进行，而且不同肿瘤病灶的基因状况和生物学行为存在着显着的异质性。
因而，液体活检技能这一新式的病理检测手法应运而生。液体活检首要包含循环肿瘤细胞 (Circulation tumor cells, CTC) 、循环肿瘤 DNA (Circulation tumor DNA, ctDNA) 、外泌体 (Exosomes) 、细小 RNA(microRNA，miRNA) 等，首要检测包含血液、唾液、尿液、腹水、胸水、脑脊液在内的体液。本文侧重对 ctDNA 在消化道肿瘤方面的临床运用现状和远景进行论述。
ctDNA 的简述
早在 1948 年，Mandel 和 Métais 首要报导血液中存在片段化的 DNA，即血浆游离 DNA（cell-free DNA，cfDNA）。1977 年，Leon 等人观察到肿瘤患者的 cfDNA 水平要显着高于健康人群，而在化疗后 cfDNA 水平会下降。
1994 年，科学家榜首次在 cfDNA 检测到 KRAS 骤变，然后证明这种带着了骤变信息的循环 DNA 是来历于肿瘤细胞。ctDNA 是原发肿瘤安排、循环肿瘤细胞、其他器官安排中搬运灶经过坏死、凋亡或直接排泄的办法开释到外周血的 cfDNA。其带着了肿瘤的基因变异特征，如骤变、刺进、缺失、重排、拷贝数反常和甲基化等，这一特色使其成为潜在的生物标志物。
ctDNA 片段巨细不等，在 70～200 bp 的小片段至 21000 bp 的大分子内动摇，而且比非肿瘤性 cfDNA 大。其数量和性质遭到多种要素影响，比方肿瘤负荷巨细、肿瘤状况、DNA 的铲除及降解机制等。cfDNA 的半衰期从 16 分钟至 2.5 小时不等，其检测技能类型繁复，每种剖析办法均有其各自的适用范围，各有利弊。其间首要的是以聚合酶链式反响（polymerase chain reaction，PCR）或二代测序（next generation sequencing，NGS）为根底的高灵敏性、高通量检测技能，它们能够在血液中许多正常的 cfDNA 中辨别出少数肿瘤 DNA。
以 PCR 为根底的常用检测办法灵敏度较高，可达 0.001%～0.1%，包含检测办法有数字 PCR（digital PCR，dPCR）、微滴式数字 PCR（droplet digital PCR，ddPCR）、实时定量荧光 PCR（Real-time PCR，RT-PCR）、BEAMing（beads，emulsion，amplification，and magnetics），而 NGS 为根底的高通量检测办法能够供给更多基因组学信息，常用的检测办法有全基因组测序、全外显子测序、TAm-Seq（tagged-amplicon deep sequencing）、Safe-SeqS（safe-sequencing system）等。
ctDNA 在消化体系肿瘤中的运用
ctDNA 在临床实践中具有很大的运用价值，其经过无创、快捷的检测手法，实时监测患者疾病的开展，辅导挑选医治战略，弥补了传统病理检测有创、活检安排量小等缺少。现在，ctDNA 的检测已在消化体系肿瘤的全程办理中锋芒毕露，在疾病的不同分期均可发挥作用，详细可概括为：
· 筛查或前期确诊
针对兼并有前期危险要素的患者以有用技能完成早诊早治，可有助于改进预后。多项研讨发现肿瘤患者和健康对照组血浆 ctDNA 的水平有统计学差异，例如 Kim 发现胃癌患者 cfDNA 水平显着高于健康对照组，且开展期胃癌患者 cfDNA 水平高于前期胃癌患者。Park 等人得到类似的成果，他们发现胃癌患者 cfDNA 浓度均匀为健康对照组的 2.4 倍。
胰腺癌和原发性肝细胞癌中均有相同的成果。可是，现有研讨标明 ctDNA 在许多瘤种的晚期患者中 ctDNA 的检测率可高于 85%，但癌症前期患者中则相应的检出率偏低。故仅依托检测 ctDNA 水平来完成癌症早筛，作用差强人意。一项来自霍普金斯医学院的研讨考虑将 ctDNA 检测和蛋白质生物符号物相结合以添加可切除胰腺癌的检测灵敏性，而且显现出极高的特异性（99.5%）。
癌变发作过程中的前期事情之一就是表观遗传改动，包含 DNA 甲基化、组蛋白润饰等。ctDNA 相同可反映癌症患者的表观遗传学特征，而且经过对表观遗传改动的检测可协助癌症的前期确诊。Lofton-Day 等发现 SEPT9 DNA 甲基化与结直肠癌的发作相关，显现其在结直肠癌前期确诊中的运用潜力。
尔后多项国内外临床研讨均证明血浆 SEPT9 DNA 甲基化适用于结直肠癌前期确诊，其确诊灵敏度为 79.3%～95.6%，特异性为 84.8%～99.0%。5-羟甲基胞嘧啶（5 hmC）是近来发现的新式表观遗传学标志。最近的研讨标明，根据 5 hmC 生物符号物的 cfDNA 检测在结肠直肠癌和胃癌中有高度猜测价值，且优于惯例的生物标志物，和安排标本 5 hmC 生物符号物检测相差无几。
ctDNA 用于肿瘤前期确诊的另一个难题，即发现癌症相关的骤变后，怎么断定肿瘤的来历。2017 年美国加州大学圣地亚哥研讨团队提醒表观遗传学检测可协助断定肿瘤发作的方位。该团队发现人体中的每个安排都有其共同的甲基化谱，经过筛查血浆中 cfDNA 的 CpG 甲基化单倍型标签能够完成对癌变安排的定位。该办法对结肠癌的灵敏度和特异性均超越 90%。
全体上，现在选用 ctDNA 检测技能对前期癌症患者的确诊依然处于科研探究阶段，作为一些热门骤变的初筛和肿瘤安排检测的弥补，愈加广泛的临床运用还需更多循证医学根据的支撑。
· 术后检测剩余病灶及猜测复发
ctDNA 半衰期短，仅答应在几个小时的距离内动态点评肿瘤状况，这种快速铲除使 ctDNA 检测能够愈加准确地监测肿瘤患者医治过程中的肿瘤动态和负荷改动，有助于手术切除患者检测剩余病灶及猜测复发，且往往可提早于传统的印象学查看发现复发。
早在 2002 年就有一项回忆性研讨发现经治的 25 例Ⅰ～ Ⅲ期结直肠癌患者中，能 ctDNA 阳性的患者 2 年无复发作存率为 66%，而 ctDNA 阴性的患者则为 100%，最终提醒 ctDNA 检测可提示患者复发危险较高和总生存期较短。还有一项前瞻性研讨归入了 230 例行彻底治愈性切除的 II 期肠癌患者，其间 178 例患者未行辅佐化疗。有 14 例（7.9%）患者术后检测到 ctDNA 阳性，其间 11 例（79%）中位随访 27 个月后呈现复发，而 164 例术后 ctDNA 阴性患者中只要 16 例（9.8%）患者呈现复发。
而在承受辅佐化疗的患者中，化疗完毕后 ctDNA 阳性与较低的无复发作存率 (recurrence-free survival,RFS) 相关。这个研讨团队后续还对 III 期肠癌患者进行了研讨，并将研讨成果报导于 2018ASCO。最新的研讨归入了 95 例 III 期结肠癌患者，一切患者术后悉数承受辅佐化疗，其间有 19 例患者术后 ctDNA 为阳性。
研讨发现术后 ctDNA 阳性患者的无复发作存率 (recurrence-free survival,RFS) 显着低于术后 ctDNA 阴性患者。术后化疗 2 个月后，59% 患者的 ctDNA 由阳性转为阴性，这部分术后 ctDNA 转阴的患者有更好的 RFS，而术后 ctDNA 由阴性转为阳性患者 RFS 更低。以上成果均提示 ctDNA 可显现出印象学无法展示出的残留肿瘤状况，并可作为辅佐医医治效的目标。
ctDNA 水平与肿瘤负荷及分期相关，结合结直肠癌分子特征监测 ctDNA 中特定基因骤变位点、反常甲基化和拷贝数变异水平的改动等可用于点评肿瘤医治作用、细小残留病灶，并作为监测复发和预后点评目标，较现有临床常用的血浆蛋白标志物或许具有更好的灵敏度和特异性。多项研讨还显现运用 ctDNA 监测复发能比印象学查看均匀提早 10 个月发现复发。
· 辅导靶向用药、动态监测医治反响、判别预后
关于晚期患者来说，首要的医治战略是以全身体系医治为主的归纳医治。而在曩昔的 20 年中，靶向医治手法蓬勃开展，已在多个瘤种中广泛运用，拟定个别化医治战略是当时精准医疗开展的中心道路。现在，ctDNA 中基因变异信息为根底的肿瘤分子分型能够极大地便利肿瘤个别化医治的靶点挑选。
人表皮生长因子受体-2 (human epidermal growth factor receptor-2, HER-2) 是现在胃癌靶向医治研讨中最首要的靶点之一。来自本单位实验室的研讨对晚期胃癌患者 ctDNA 和配对肿瘤安排中 HER2 扩增的一致性做出剖析，成果显现 ctDNA 的 HER2 扩增与肿瘤安排具有高度一致性（91.4%），标明根据 ctDNA 的点评能够部分战胜肿瘤异质性，并可成为胃癌 HER2 剖析的潜在代替目标。
几项研讨报导 KRAS 在安排中的骤变状况与结直肠癌患者的 ctDNA 高度一致（78.3%～97%），NRAS 和 BRAF 的骤变也是如此。值得注意的是，在一些状况下，根据血液的剖析可检测到在手术标本中未检测到的 KRAS 骤变。这或许反映了安排活检中遗失的但被 ctDNA 捕获的肿瘤异质性，并阐明晰运用安排作为金规范的缺少。另一项研讨也证明 ctDNA 剖析发现更多的骤变，经过 ctDNA 剖析发现患者 KRAS，NRAS 和 BRAF 骤变的份额分别为 59%，11.8% 和 14.4%，而经过肿瘤安排发现的骤变的份额分别为 44%，8.8% 和 7.2%。
来自 2018 ASCO 的一项研讨为搬运性结直肠癌患者靶向医治前运用 ctDNA 检测功能性基因交融供给了根据。研讨选取了未承受抗肿瘤医治的结直肠癌外周血进行 ctDNA 二代测序，4290 例患者中有 41 例检测到 45 种共同的交融（0.96%），其间，RET（16 例，0.37%）、FGFR3（13 例，0.30%）、ALK（10 例，0.23%）、NTRK1（3 例，0.07%）、ROS1（2 例，0.05%）、FGFR2（1 例，0.02%），4 例患者发作多个基因交融现象，FGFR 基因交融与 RAS 基因骤变相关（OR3.5，p = 0.03），悉数 NTRK1 基因交融均为 KRAS/NRAS/BRAF 野生型，基因组改动在呈现基因交融的患者中更为常见。
研讨成果证明根据血浆检测交融基因是可行的。这些罕见特别基因变异的检出为这不到 1% 的患者供给了新的医治或许。
靶向药物的运用往往会面临着耐药的呈现，经过外周血 ctDNA 能够得出循环中肿瘤分子的改动谱。循环基因组的瞬间状况更能代表肿瘤不同区域的异质性，这比安排活检更早地承认和发现医治耐药性的呈现。Misale 等人运用 ctDNA 对西妥昔单抗或帕尼单抗耐药的结直肠癌患者进行剖析，成果显现 60% 患者中获得了继发性 KRAS 骤变，而且这种改动较印象学查看发现的疾病开展提早了 10 个月。
另一项研讨中选取了 28 例予以帕尼单抗医治的搬运性结直肠癌患者，其间 24 例为 KRAS 野生型，经过 ctDNA 检测发现，9 例患者（38%）开始为 KRAS 野生型患者医治过程中可检测出 KRAS 骤变，其间 3 位患者可检测出多种不同方式 KRAS 骤变。
克唑替尼是一种有用的 MET 抑制剂，已被证明对 MET 扩增的食管癌和胃癌有用。约 5% 的胃癌患者发作 MET 扩增，可是，克唑替尼医治不久即发作肿瘤开展。现在有研讨经过 ctDNA 对 IV 期胃癌患者承受克唑替尼医治 2 个月发作耐药剖析其分子机制，成果提醒了多重继发 MET 骤变、FGFR2 基因相对拷贝数显着添加及其他相关下流信号的骤变 [44]。
最近有学者提议将外周血 ctDNA 检测的成果归入到更新的 TNM 肿瘤分期体系，即「TNMB」分期体系，具有更好的确诊、医治、预后价值。「B」的界说为未检测到（「B0」）或检测到（「B1」）ctDNA。
Tjensvoll 等分别收集了确诊的胰腺癌患者化疗前和化疗后每个月的血浆样本，接连监测了 14 例晚期胰腺癌患者的血液 ctDNA 的 KRAS 基因改动（存在 KRAS 骤变即 ctDNA 阳性），其间在化疗前 ctDNA 阳性的 10 例患者中，其 ctDNA 量的改动和印象学点评呈一致性，特别是有 3 例患者，他们 ctDNA 的改动较 RECIST 作用点评提早 1-2 个月。
2018 ASCO 也有多个运用 ctDNA 监测医治反响、猜测作用的研讨。胃肠道肿瘤方面， HERACLES 实验（NCT02476045）证明血浆 HER2（ERBB2）拷贝数可猜测 HER2 靶向医治反响。研讨发现 ctDNA 可判定 96% 的 ERBB2 扩增的样本，并能准确猜测 HER2 靶向医治的缓解率。根据 HERACLES 和大型临床行列，血浆中 ERBB2 的拷贝数阈值设定为 3 可用来猜测从 HER2 靶向医治中获益的患者。
免疫医治无疑是最近最炽热的研讨方向，怎么更好地猜测免疫医治的作用，特别是怎么区别免疫医治的真性开展或假性开展一直是研讨者重视的要点。
近来就有研讨对运用免疫医治的黑色素瘤患者接连进行 ctDNA 检测然后区别出免疫医治的真性开展或假性开展 [50]。研讨归入 125 例承受 pembrolizumab 或 nivolumab 联合或不联合 ipilimumab 医治的 IV 期黑色素瘤患者，用 RECISIT 1.1 规范及 irRC 规范进行作用点评，假性开展界说为榜首次印象学点评（第 12 周）时肿瘤负荷添加 25%，但在第2次点评中疾病开展没有得到承认。
其间 29 例患者在榜首次作用点评时，疾病呈现开展。而真性开展的患者 20 例，假性开展的患者 9 例。这 9 例假性开展患者其间 2 例（22%）患者基线时和医治后均无法检测到 ctDNA，4 例（44%）患者基线时能够检测到 ctDNA，但医治后下降到无法检测，3 例（33%）患者 12 周后 ctDNA 浓度下降大于 10 倍。至于 20 例患者为真性开展的患者，其间 18 例（90%）患者 ctDNA 量显着升高。阐明动态监测 ctDNA 改动能够辨认假性开展的灵敏度为 90%，特异性为 100%。虽然这一研讨成果是在黑色素瘤患者中进行探究的，但关于消化体系肿瘤方面仍具有必定提示含义。
因而关于不行切除的晚期肿瘤患者来说，ctDNA 可动态监测化疗及靶向医治的反响及监测耐药，然后及时反响患者的病况，承受医治的作用，辅导医生判别预后及挑选更适宜的医治战略。
ctDNA 检测的局限性和面临的应战
ctDNA 作为液体活检的重要组成部分，在消化体系肿瘤的个别化医治的临床实践的不同阶段和方面发挥着越来越重要的作用，运用远景宽广，但开展过程中相同要面临许多质疑和应战，还有许多问题需求处理。
榜首，液体活检检测技能办法品种许多，可是缺少行业规范，而临床中关于任何一项面向患者的检测技能，不管在特异度、灵敏度和检测稳定性都有较高要求。虽然最近开发了十分灵敏的技能，但为癌症前期筛查开发牢靠的检测依然充溢应战性。特别是，在广泛的人群中筛查需求准确的特异性。癌症相关的基因骤变跟着年纪的增加而发作，即使是在其一生中从未发作过癌症的个别也有或许会带着某些特定的骤变基因，这或许导致假阳性成果。
第二，现有 ctDNA 检测收费相对比较贵重，怎么改进技能一起下降成本，减轻肿瘤患者经济负担仍需尽力。
第三，在将液体活检全面运用到临床的过程中，需要更多大型临床研讨的支撑，特别是前瞻性研讨。
最近美国临床肿瘤学会（ASCO）和美国病理医生学会（CAP）安排了专家委员会，对已宣布的 1338 篇临床 ctDNA 检测的论文进行总述性剖析，从剖析效度、临床有用性及临床功效对 ctDNA 的临床运用做出剖析，文中特别指出经过比较肿瘤安排和血浆中致病骤变的一致性时，有许多生物学要素或许影响这种一致性，比方肿瘤类型、肿瘤异质性、安排和血液取样时刻、骤变为克隆或亚克隆。
文章以为当时还没有牢靠的根据证明 ctDNA 对肿瘤动态检测的临床有用性。关于临床等待的 ctDNA 对前期肿瘤的筛查，专委会以为其临床有用性根据适当有限，也没有满足的根据支撑 ctDNA 检测对患者预后和花费有改进，总归，这篇文章并不是否定 ctDNA 未来运用的价值, 而更多是给当时大红大紫的 ctDNA 液体活检带来更为理性的剖析和考虑。
结语与展望
综上所述，在精准医疗布景下，ctDNA 在临床中对不一起期的肿瘤有不同的运用价值，可完成前期筛查、确诊，肿瘤切除后检测剩余病灶、监测复发，一起协助晚期患者更好地挑选靶向药、动态监测医医治效，进行有用的预后点评以到达医治作用最大化。液体活检推动了个别化医治以及精准医疗的的脚步，但现在还需求大规模的前瞻性研讨来断定其对不同肿瘤不同分期的有用性和灵敏性。
